TUhjnbcbe - 2024/4/7 17:29:00
本人发现很多研究人员对分子生物学的基础知识处于一知半解，甚至于本人也存在非常多的知识空白。因此在经过考虑后决定出一个新的栏目，主要是《分子克隆实验指南（第四版）》内容的搬运，期间会对重要的基础内容增加标识和备注，也是对自己以往实验进行梳理并对基础知识查漏补缺。DNA分离DNA的分离是分子生物学实验的基础，高纯度的DNA也许会是实验的关键。DNA制备得越纯，DNA作为模板或者底物的酶反应效率会越高。一般来说分离DNA的方法，主要有以下3个步骤：1.细胞裂解：离子去污剂，如SDS离液剂（如胍盐）与离子去污剂结合的碱2.从细胞中释放DNA，去除与DNA结合的蛋白质并快速使胞内核酸酶失活，如：酶水解蛋白和RNA从层析液中吸收、释放DNA（例如，玻璃粉末或者阴离子树脂；市面上大部分商品化DNA纯化试剂盒是基于该技术进行开发的）利用有机溶剂（苯酚和/或氯仿）抽提裂解液以去除DNA溶液中的蛋白质3.利用乙醇或者异丙醇沉淀DNA去除盐离子使用碱与SDS裂解法从大肠杆菌中分离制备质粒DNA己有30多年的历史，菌液在高pH条件下加入强离子去污剂能够破坏细胞壁，使蛋白质与染色体DNA变性。溶菌过程中，菌体蛋白、破碎的细胞壁和变性的染色体DNA交织成一个大的复合物，被十二烷基硫酸盐包裹。这些复合物能够通过将钠离子替换成钾离子而被有效沉淀下来。离心去除变性剂后，就可以从上清液中回收复性的质粒。在SDS的存在下，碱裂解法是一种非常灵活、有效的方法。但是，实验中的关键是要动作快，因为长时间暴露在变性的条件下会对闭环DNA造成不可逆变性，这种变性的折叠卷曲DNA不能被限制酶切割，它的琼脂糖电泳速率是线性、超螺旋和环状等天然结构DNA电泳速率的两倍，并且不易被嵌入染料染色。质粒电泳会出现三个条带商业公司将过去DNA提取与纯化的技术应用到试剂盒中，然后出售。它是预包装的试剂，具有非常清楚并且简洁的说明，对操作人员的要求简单，使操作人员很容易快速上手，并且结果可多次重复。但试剂盒就像快餐食物一样：简单、不用思考、无创造力，也就造成了很多新研究者忽略了基础专业知识的学习目前市面上的DNA纯化试剂盒通常利用二氧化硅或者硅酸盐的特性进行DNA纯化。在高pH、高盐缓冲液中，DNA吸附在二氧化硅介质上，在低盐浓度下可被洗脱下来。一旦被吸附，在溶液中（如50%乙醇）的DNA还可以被吸附在介质上，而与其他的生物多聚物（如RNA和糖）分开。然而，当用水溶液对吸附的DNA进行水化时，DNA可被洗脱下来并（大部分）在洗脱液中被回收。得率由DNA的大小决定：片段越小，与二氧化硅结合越紧密，得率越低。洗涤缓冲液，尤其含易挥发液体的（如乙醇），应该现用现配。DNA定量常规使用3种方法进行DNA定量：紫外分光光度法、荧光分析法和绝对定量法。1.紫外分光光度法紫外分光光度法是利用分光光度计来测定DNA溶液的吸收值。在水相中，双链DNA在nm附近具有最大吸光度，吸光系数约为50。实际上，双链DNA的紫外光谱范围从约4μg/mL到约50μg/mL。然而，分光光度计法定量对多种干扰成分十分敏感，这些成分可以是单链DNA、RNA、蛋白质、核苷酸、含有苯环的芳香族化合物及溶液中的颗粒等。通过测定单波长（nm）下的吸光度来定量核酸浓度实际效果并不好。样品的吸光度可以在多个波长下（nm、nm、nm与nm）进行测定，因为在这些波长下的吸光度可指示样品制备的纯度。nm：胍盐、苯氧基离子、硫氰酸酯及其他经常用于核酸制备的化合物在该波长下具有强吸收。nm：芳香族氨基酸色氨酸和酪氨酸在该波长下具有强吸收。多年以来，nm与nm的吸光度比值一直用于检测核酸中是否污染了蛋白质。这项测定尽管十分普遍，但却值得怀疑。这个方法需追溯到Warburg和Christian（）的研究，他们发现OD/OD比值是核酸中是否污染蛋白质的很好的指示。但事实上这并不是真的！DNA在nm的吸收很强，只有在被大量蛋白质污染的条件下才会引起两个波长下吸光度比值的显著变化。nm：在高波长下的吸收一般是由光散射造成的，可用于指示核酸制备过程中特定物质引起的浊度。根据实验经验，OD/OD比值在1.7~2.0，并且在nm和nm处吸收度较小的DNA制备物，被认为是纯度足够高，可以作为分子克隆各个过程中的模板和底物。目前常用NanoDropTechnologies销售的分光光度仪测定微量体积DNA、RNA和蛋白质的吸光度。这种分光光度仪利用光束下表面张力仅需要微量液滴（1~2μL），此外，NanoDrop分光光度仪不需要稀释即可测定高浓度的DNA溶液。并且仪器接触样品的表面非常容易并快速地被清洗，因此可在短时间内测定多个样品。使用NanoDrop时需要注意以下几点：确保DNA溶液在测定前充分混匀。因为样品体积很小（2μL）,没有混匀会使取得的样品不具有代表性。少量体积样品加入到分光光度仪的底座后，会很快挥发，并导致测出的DNA浓度比实际的要高。为减少这个问题的影响，可将NanoDrop分光光度仪放在温度可控、通风的环境下，并保持样品放置于盖了盖子的管中。操作要快。应该在样品加到分光光度仪底座后尽快读数。NanoDrop.荧光分析法荧光分析法用特定结合DNA的染料来测定双链DNA的浓度。常用的DNA染料包括溴化乙锭、Hoechst、SYBRGreenI和II、SYBRGold及PicoGreen。溴化乙锭：溴化乙锭可嵌入到双链DNA碱基之间，在高强度离子溶液的饱和状态，大约每2.5个碱基对嵌入一分子的溴化乙锭，这与DNA的碱基组成无关。溴化乙锭的嵌入一般不会对碱基对的构象及其在螺旋中的位置产生影响，除了会使碱基对沿螺旋轴移位3.4。这种移位可造成饱和溴化乙锭的DNA分子长度增加27%。溴化乙锭平面基团的固定位置及其与碱基的密切接近可使结合的染料散发的荧光比游离在溶液中的染料要强20-25倍。溴化乙锭主要用于检测琼脂糖中的DNA，但这种染料也还可以用于半定量地估算DNA溶液的浓度。溴化乙锭可通过两次等体积的异丙醇或酚：氯仿(25：1)萃取，非常容易并快速地从DNA中去除。去染色的DNA可再通过乙醇沉淀回收EB结构式以及嵌入双链的方式Hoechst：Hoechst是一类双-苯并咪唑荧光染料，可高特异性非插入地结合于DNA双链的小沟。结合的染料产生的荧光从0.01上升到0.6。因此，Hoechst用于双链DNA溶液的荧光检测及定量，并且具有非常强的区分双链DNA与RNA及单链DNA的能力。此外Hoechst可优先结合DNA螺旋中的富含A/T区，并随着A+T含量的增加，荧光强度以10的对数增长。Hoechst与双链DNA结合产生的荧光比与单链DNA结合要强3倍左右。SYBRGreenI：SYBRGreenI是一种嵌入型青蓝色染料，在nm蓝色光照射激发后，在nm绿光具有发射高峰。尽管SYBRGreenI可加入到凝胶上样缓冲液中，但并不推荐这样使用，因为该染料对DNA在凝胶中的迁移影响很大。为得到最好的效果，凝胶应该进行预染处理。由于产生的荧光很强，SYBRGreenI是一种可用于检测少量DNA(低拷贝/PCR产物数量少)的理想染料。少至20pg的DNA或pg多分散性DNA在经过SYBRGreenI染色后，凝胶可用基于CCD的图像记录系统进行检测。SYBRGreenII：SYBRGreenII主要用于对电泳后的RNA和单链DNA进行染色。由于该染料在结合RNA后发出非常亮的荧光及其在凝胶中的低背景，SYBRGreenII经常用来对多聚甲醛/琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶中的RNA进行染色。SYBRGold：SYBRGold是检测凝胶中DNA和RNA高度灵敏的染料，与nm紫外光源和基于CCD的图像记录系统联合使用。结合DNA后，SYBRGold在nm和nm处均有最大激发(最大发射波长nm)。结合核酸后，SYBRGold的荧光增强程度是溴化乙锭的30多倍。SYBRGold染凝胶中DNA的灵敏度是SYBRGreenI的10多倍，染乙醛酸化的RNA的灵敏度是溴化乙锭的25倍以上。SYBRGold也可用于检测甲基敏感的单链构象分析(MS-SSCA)。然而，由于其成本较高，SYBRGold并不是检测凝胶中DNA或DNA定量的常规选择染料。Ames实验显示SYBRGold并不具有诱变作用，并且不像其他菲啶类染料如溴化乙锭，SYBRGold可很容易地通过乙醇沉淀法从DNA中去除。PicoGreen：PicoGreen是一种耐光性染料，在nm处有最大激发，在nm处有发射高峰，可特异结合双链DNA。在检测溶液中双链DNA时，其具有最高灵敏度和最大动力性范围。可检测1~ng/mL的DNA样品，并可通过手持型荧光分析仪进行精确定量。PicoGreen结构式与DNA结合示意图3.绝对定量法一种基于TaqMan系统的商业化产品为DNA绝对定量提供了有效方法。TaqManRNasePDetectionReagents系统使用TaqMan化学法检测基因组DNA的总量，后者可通过特异针对人RNaseP基因的引物进行扩增。TaqMan探针包括：①结合到针对RNaseP基因的非延伸寡核苷酸3‘端的猝灭分子；②结合到引物5’端的报告分子。猝灭分子［罗丹明、异硫氰酸四甲基罗丹明（TAMRA）］发射长波长红光光谱，而报告分子（荧光素，FAM）发射短波长的绿光。猝灭分子与报告分子距离很近时，可发生从猝灭分子到报告分子的荧光共振能量转移（FRET）,这有效抑制了报告分子的荧光。设计荧光标记的寡核苷酸，用于上下游未标记引物所扩增靶序列的复性。由具有5‘→3’外切酶活性的热稳定DNA聚合酶（如Taq）催化的DNA合成可引起探针的水解以及激光照射后荧光强度增加。目前已经有商业化试剂盒利用TaqManUniversalPCRMasterMix完成5‘核酸酶检测，这类试剂盒中含有预稀释的系列浓度的DNA参照品。