乙醇酸氧化酶活性的测定上海液质检测平台 [复制链接]

乙醇酸氧化酶（GO）是光呼吸代谢的关键酶，也是光下合成草酸的关键酶，它催化乙醇酸氧化生成乙醛酸，也可进一步催化乙醛酸氧化生成草酸，两个反应都伴有过氧化氢的产生。测定GO活性的方法有多种，如氟电极法、盐酸苯肼紫外分光光度法、盐酸苯肼-铁氰化钾比色法、二氯酚靛酚还原法等，但根据我们多年的研究经验，介绍两种比较精确而实用的方法。

1仪器设备

冷冻高速离心机、可见光光度计、恒温水浴、秒表。

2操作方法

2.1盐酸苯肼-铁氰化钾比色法（PlantCellPhysiol，，19：）

2.1.1酶提取：称取0.5g植物叶片，加入5mlmmol/L磷酸缓冲液（pH8.0），充分匀浆后用r/min冷冻离心15min，上清液可作为粗酶液备用。如需进一步提纯GO，请参考彭新湘和李明启（，植物生理学报，15：）。

2.1.2酶活性测定：向试管中加入0.75mlmmol/L磷酸缓冲液（pH8.0），0.1ml1mmol/LFMN，0.05ml粗酶液（可根据不同材料作适当稀释，使最后的OD读数在0.5左右为宜），摇匀后在30℃水浴中平衡10min，然后加入0.1ml50mmol/L乙醇酸启动反应（以加入0.1ml蒸馏水作空白调零）。反应5min后加入0.1ml2NHCI中止酶活性，然后加入0.1ml1.82NaOH中和其酸性，混匀后加入0.2ml0.33%盐酸苯肼（溶于0.15N盐酸中，现配现用），反应10min后在通风柜中加入1ml浓盐酸，摇匀冷却后加入0.2ml1.65%的铁氰化钾，显色20min后于nm处比色测定。

2.1.3标准曲线的制作：用mmol/L磷酸缓冲液（pH8.0）配成0、20、40、60、80、μmol/L的乙醛酸溶液，各取1ml，然后按上述步骤进行显色，绘制标准曲线。

2.2酶偶联法（Phytochem，，24：）

2.2.1酶提取同上。

2.2.22mlmmol/L磷酸缓冲液（pH8.0），0.1ml30mmol/L4-氨基安替吡啉（4-amino-antipyrine），0.1ml单位/ml辣根过氧化物酶（现配现用），0.3ml20mmol/L苯酚（现配现用），0.3ml1mmol/LFMN，0.1ml粗酶液（可适当稀释使其OD值每分钟上升0.1单位左右为宜），摇匀后在30℃恒温水浴中保温10min（水浴置于分光光度计旁），加入0.1mlmmol/L乙醇酸后摇匀后迅速倒入1cm光径的玻璃比色杯中观测nm处的吸收值的上升速率，每30s读数1次，共观测3min。

2.2.3标准曲线的制作：以标准过氧化氢代替乙醇酸，使其终浓度为20、40、60、80、μmol/L，然后在nm处比色测定，制作标准曲线。

3注意事项

3.1盐酸苯肼-铁氰化钾比色法（PlantCellPhysicl，，）尤其适合于大量样品的分析测定，并且其结果易于肉眼判断，重复性较好。但因本法的原理是测定乙醛酸的生成量，如形成的乙醛酸继续被氧化生成草酸，可能会使测定值偏低。然而GO对乙醛酸的亲和力大大低于乙醇酸，其Km值一般是乙醇酸的30倍，所以只要反应时间足够地短（一般反应5min便中止反应），可基本保证测定的准确性。

3.2酶偶联法（Pbytochem，，24：）是利用过氧化物酶及其底物与产生的H2O2反应后生成有色产物来确立GO催化反应的速率。由反应式CH2OH-COOH＋O2=CHO-COOH+H2O2）可知，产生多少摩尔H2O2也就生成了多少摩尔的乙醛酸。此法的优点是灵敏、不易受色素干扰，重复性好，结果也易肉眼判断。但此法可能会受粗酶液中的过氧化氢酶活性的干扰使结果偏低，但只要加入足量过氧化物酶（一般每管3～5单位即可），酶浓度不太高的情况下，这种误差可忽略不计。